变异链球菌密度感应系统调控变链素的研究进展
【摘要】 密度感应是指细菌根据菌群密度的变化分泌和感应信号分子-感受态调节肽（CSP），调控相关基因的表达。变链素是变异链球菌合成分泌的抗菌性多肽，在菌群中可调节相关细菌的生物学行为。变异链球菌密度感应系统可调控变链素的合成和分泌，参与菌群间的交流，调控牙菌斑生物膜的稳定性。下面就近年来受密度感应系统调控的变链素的研究进展作一综述。
【关键词】 变异链球菌； 密度感应； 变链素
细菌素是细菌在代谢过程中合成和分泌到周围菌群中的抗菌性多肽，是伴随核糖体合成机制产生的一类有抑菌活性的蛋白质，革兰阳性菌和革兰阴性菌均可产生细菌素。革兰阳性菌产生的细菌素依据翻译后修饰过程的不同分为2类[1]：一类是先由核糖体合成一个前体多肽，再经过一系列翻译后修饰形成的细菌素，因分子中含有羊毛硫氨酸的结构，被称为羊毛硫细菌素；另一类是翻译后不被修饰的细菌素，被称为非羊毛硫细菌素。细菌通过分泌细菌素对周围同种或异种细菌产生抑制，这种特性备受研究者关注。
变异链球菌是导致人类龋病的主要病原微生物，所产生的细菌素称为变链素。根据其产生菌株的不同，可将变链素相应命名为变链素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ等。变链素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ属于羊毛硫细菌素家族，可对与其密切相关的菌种和周围其他革兰阳性细菌产生抑制作用；因此，变链素有望成为一种抗菌剂以杀死其他细菌，这一活性使变链素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ基因及其蛋白水平的研究广泛而深入。变链素Ⅳ属于非羊毛硫细菌素家族，其活性与变异链球菌密度感应系统密切相关，成为近年来研究的热点。
1 变链素Ⅳ
Qi等[2]在采用反相高压液相层析技术对Ⅰ型变异链球菌UA140产生的细菌素进行研究时发现了UA140的两个波峰，经过对这两个波峰的分析发现，UA140可产生两种细菌素：一种是羊毛硫细菌素——变链素Ⅰ，另一种是非羊毛硫细菌素，故将其命名为变链素Ⅳ。电子电离质谱分析发现，变链素Ⅳ属于非羊毛硫细菌素家族的二聚体细菌素，单体A的相对分子质量为4.169×103，单体B的相对分子质量为4.826×103。DNA和氨基酸序列分析发现，单体A由nlmA基因编码，由44个氨基酸组成；单体B由nlmB基因编码，由49个氨基酸组成。抗菌谱分析发现，变链素Ⅳ对口腔链球菌属大部分细菌有抑制活性的作用，但对放线菌属没有影响，这暗示变链素Ⅳ在菌间竞争中有重要作用。van der Ploeg[3]在采用lacZ报告基因检测nlmA、B基因表达的变化时发现，编码密度感应调控系统的comC、D、E基因突变时，nlmA、B基因表达明显下降，感受态刺激肽（competence stimulating peptide，CSP）可弥补comC突变体中nlmA、B基因的表达，但不能弥补comD、E突变体的表达；而CSP后期调控comX基因以及另外两个双组份信号调控系统编码基因ciaRH、vicRK突变对nlmA、B基因表达无明显影响。该研究结果提示，变链素Ⅳ是受comC、D、E基因密度感应系统调控产生的。
变链素Ⅳ产生的量在对数生长晚期至稳定期早期达到最大，而浮游状态生长的变异链球菌产生的变链素Ⅳ的量较细胞平板培养时明显下降。变异链球菌在细胞内产生变链素Ⅳ后，由nlmT、E基因编码的转运蛋白与变链素Ⅳ结合并将其运送到细胞外发挥作用[4]。Kreth等[5]将变异链球菌野生株和nlmA、B基因突变株分别与携带穿梭质粒DNA的戈登链球菌共培养，以观察穿梭质粒DNA转化变异链球菌的转化率。结果显示，nlmA、B基因突变株的转化率低于野生株。将纯化的变链素Ⅳ加入到变异链球菌野生株和nlmA、B基因突变株内，实时定量PCR检测戈登链球菌释放游离DNA的质量浓度，结果变链素Ⅳ可以使戈登链球菌释放更多的游离DNA。
Petersen等[6]采用绿色荧光染料检测菌斑生物膜中游离DNA的质量浓度，即在菌群中未加入CSP信号蛋白时，游离DNA的质量浓度达到了85 μg/L；在加入CSP信号蛋白后，游离DNA的质量浓度迅速增加至760 μg/L。该研究再次证明，变异链球菌通过密度感应系统调控菌斑生物膜中游离DNA的质量浓度来调控自身的生物学行为。
2 变链素Ⅴ
Hale等[7]在采用PCR连接诱变技术[8]诱变变链素相关编码基因研究变异链球菌UA159产生非羊毛硫细菌素的种类时发现，除nlmA、B基因编码的变链素Ⅳ外，还有一种新的非羊毛硫细菌素与变链素Ⅳ有相似的抑制指示菌株的作用，并可与变链素Ⅳ产生协同作用。该细菌素由SMU 1914c编码，随后将SMU 1914c命名为nlmC基因，该细菌素被称作变链素Ⅴ。
Kreth等[9]发现，nlmC基因和一组类细菌素编码基因启动子区域大约有130 bp的序列与nlmA基因序列高度同源，尤其是变链素Ⅴ编码的基因启动子区域与nlmA基因有204 bp的同源序列；comE基因突变后，此类基因不表达，提示该同源序列可能为ComE调控因子的结合区域，变链素Ⅴ的产生同样受comC、D、E基因密度感应系统调控。Kreth等[10]进一步研究发现，nlmC基因启动区域有DRⅠ和DRⅡ两个11 bp的重复序列。电泳迁移率变动分析显示，纯化的ComE蛋白结合到这两个重复序列产生两个迁移条带，突变两个重复序列使ComE蛋白不产生迁移条带，从而证实了nlmC启动区域存在着ComE蛋白结合位点，而变异链球菌素调控机制由comD、E基因系统调控，不同于肺炎链球菌由comD、E基因和blpR、H基因这两个系统调控[11]。密度感应系统对变链素Ⅴ详尽的调控机制和变链素Ⅴ对牙菌斑生物膜的影响有待于继续深入的研究。
3 变异链球菌素
Longo等[12]发现，变异链球菌GS5合成的一种细菌素属于羊毛硫细菌素，但不属于变链素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ任何一个家族。Yonezawa等[13]对该细菌素进行了深入的研究后将其命名为变异链球菌素
（S.mutans bacteriocin，Smb），并采用Tn916诱变技术和单特异性引物PCR对Smb进行鉴定。结果发现Smb是一种二聚体细菌素，由30个氨基酸的SmbA蛋白和32个氨基酸的SmbB蛋白组成。Smb的生物合成基因组包括smbM1、T、F、M2、G、A和B等7个基因，其中smbA、B为编码基因。RNA印迹技术分析显示，在变异链球菌comC基因突变体中，smbA和smbB基因表达明显下调；DNA序列分析显示，smbA基因上游启动区域有一段序列为CSP调控基因共有的com盒（TACGAATA）[14]，且smbM1基因上游区域竟与comC基因启动子区域有93%的同源性。这就预示着Smb同样受变异链球菌密度感应系统的调控，但具体的调控机制尚待进一步研究。
4 其他变链素
变链素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的生物学性质及其调控机制已基本明确，即受变异链球菌密度感应系统调控影响不大。近年来其他的研究者又相继分离和纯化出多种变链素，例如变链素K8和变链素N[15-16]。前者为一种羊毛硫细菌素，后者为一种类似于变链素Ⅳ单体B的非羊毛硫细菌素，其具体结构和特性尚未明确。
5 结束语
对于变异链球菌素的深入了解，将有助于进一步认识口腔微生物及其与口腔生态系的关系，有助于为阻断口腔菌群间的信号传递、降低口腔菌群的致病毒力和预防龋病的发生提供一种新的控制途径。
